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  • CCK-8 細胞增殖.毒性檢測試劑盒
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    Cell Counting Kit簡稱CCK-8試劑盒·◕☁·↟,為MTT法的替代方法·◕☁·↟,是一種基於WST(水溶性四唑鹽·◕☁·↟,化學名▩✘:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用於細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒☁☁✘◕。CCK-8 細胞增殖.毒性檢測試劑盒

    Cell Counting KitCCK-8試劑盒)


    目錄號

    產品名稱

    規格

    包裝

    CC-K01

    Cell Counting Kit

    100

    1mL

    CC-K05

    Cell Counting Kit

    500

    5x1ml

    CC-K10

    Cell Counting Kit

    1000

    10x1mL

    CC-K30

    Cell Counting Kit

    3000

    30xmL


    產品簡介▩✘:

    Cell Counting Kit簡稱CCK 試劑盒·◕☁·↟,為MTT法的替代方法·◕☁·↟,是一種基於WST(水溶性四唑鹽·◕☁·↟,化學名▩✘:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用於細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒☁☁✘◕。


    CCK-8法與其它檢測方法之間的比較▩✘:

    細胞計數方法

    MTT

    XTT

    WST-1

    CCK-8

    形成的formazan的水溶性

    產品性狀

    粉末

    2瓶溶液

    溶液

    1瓶溶液

    使用方法

    配成溶液後使用

    現配現用

    無需預製

    無需預製

    檢測靈敏度

    很高

    很高

    檢測時間

    較長

    較短

    較短

    zui短

    檢測波長

    560-600nm

    420-480nm

    420-480nm

    430-490nm

    細胞毒性

    高·◕☁·↟,細胞形態完全消失

    很低·◕☁·↟,細胞形態不變

    很低·◕☁·↟,細胞形態不變

    很低·◕☁·↟,細胞形態不變

    試劑穩定性

    一般

    較差

    一般

    很好

    大批次樣品檢測

    可以

    非常適合

    非常適合

    非常適合

    便捷程度

    一般

    便捷

    便捷

    非常便捷









    CCK用途▩✘:藥物篩選▩↟·•·、細胞增殖測定▩↟·•·、細胞毒性測定▩↟·•·、腫瘤藥敏試驗

     操作說明▩✘:

    一▩↟·•·、製作標準曲線(測定細胞具體數量時)

    1▩↟·•·、先用細胞計數板計數所製備的細胞懸液中的細胞數量·◕☁·↟,然後接種細胞☁☁✘◕。

    2▩↟·•·、按比例(例如▩✘:1/2比例)依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度·◕☁·↟,一般要做3-5個細胞濃度梯度·◕☁·↟,每組3-6個復孔☁☁✘◕。

    3▩↟·•·、接種後培養2-4小時使細胞貼壁·◕☁·↟,然後加CCK試劑培養一定時間後測定OD值·◕☁·↟,製作出一條以細胞數量為橫座標(X軸)·◕☁·↟,OD值為縱座標(Y軸)的標準曲線☁☁✘◕。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(試用此標準曲線的前提是實驗的條件要*·◕☁·↟,便於確定細胞的接種數量以及加入CCK後的培養時間☁☁✘◕。)

    二▩↟·•·、細胞活性檢測

    1▩↟·•·、在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)☁☁✘◕。將培養板放在培養箱中預培養(在37,5% CO2的條件下)☁☁✘◕。

    2▩↟·•·、向每孔加入10 μLCCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡·◕☁·↟,它們會影響OD值的讀數)☁☁✘◕。

    3▩↟·•·、將培養板在培養箱內孵育1-4小時☁☁✘◕。

    4▩↟·•·、用酶標儀測定在450nm處的吸光度☁☁✘◕。

    5▩↟·•·、如果暫時不測定OD值·◕☁·↟,打算以後測定的話·◕☁·↟,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液·◕☁·↟,並遮蓋培養板避光儲存在室溫條件下☁☁✘◕。在24小時內吸光度不會發生變化☁☁✘◕。

    三▩↟·•·、細胞增值-毒性檢測

    1▩↟·•·、在96孔板中配置100μL的細胞懸液☁☁✘◕。將培養板在培養箱預培養24小時(在37·◕☁·↟,5% CO2的條件下)☁☁✘◕。

    2▩↟·•·、向培養板加入10μL不同濃度的待測物質☁☁✘◕。

    3▩↟·•·、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間(例如▩✘:6▩↟·•·、12▩↟·•·、2448小時)☁☁✘◕。

    4▩↟·•·、想每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡·◕☁·↟,它們會影響OD值的讀數)☁☁✘◕。

    5▩↟·•·、將培養板在培養箱內孵育1-4小時☁☁✘◕。

    6▩↟·•·、用酶標儀測定在450nm處的吸光度☁☁✘◕。

    7▩↟·•·、如果暫時不測定OD值·◕☁·↟,打算以後測定的話·◕☁·↟,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液·◕☁·↟,並遮蓋培養板避光儲存在室溫條件下☁☁✘◕。在24小時內吸光度不會發生變化☁☁✘◕。

    注意▩✘:如果待測物質有氧化性或還原性的話·◕☁·↟,可在加CCK之前更換新鮮培養基(除去培養基·◕☁·↟,並用培養基洗滌細胞兩次·◕☁·↟,然後加入新的培養基)·◕☁·↟,去掉藥物影響☁☁✘◕。當然藥物影響比較小的情況下·◕☁·↟,可以不更換培養基·◕☁·↟,直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可☁☁✘◕。
     備註▩✘:
    建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK試劑後的培養時間☁☁✘◕。
    有條件的情況下建議採用多通道移液器·◕☁·↟,可以減少平行孔減的差異☁☁✘◕。加入CCK試劑時·◕☁·↟,建議斜貼著培養板壁加·◕☁·↟,不要插到培養基頁面下加·◕☁·↟,容易產生氣泡·◕☁·↟,會干擾OD值讀數☁☁✘◕。
    白細胞可能需要培養較長時間☁☁✘◕。
    當使用標準96孔板時·◕☁·↟,貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 / (100 μL 培養基)☁☁✘◕。檢測白細胞時的靈敏度相對較低·◕☁·↟,因此推薦接種量不低於2,500 / (100 μL 培養基)☁☁✘◕。如果要使用24孔板或6孔板實驗·◕☁·↟,請先計算每孔相應的接種量·◕☁·↟,並按照每孔培養基總體積的10%加入CCK溶液☁☁✘◕。
    如果沒有450nm的濾光片·◕☁·↟,可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片·◕☁·↟,但是450nm濾光片的檢測靈敏度zui高☁☁✘◕。

    培養基中酚紅的吸光度可以在計算時·◕☁·↟,透過扣除空白孔中本底的吸光度而消去·◕☁·↟,因此不會對檢測造成影響☁☁✘◕。

    活力計算▩✘:

    細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A0加藥)-A(空白)] ×100
    A(加藥)▩✘:具有細胞▩↟·•·、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度
    A(空白)▩✘:具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度
    A0加藥)▩✘:具有細胞▩↟·•·、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
    *細胞活力▩✘:細胞增殖活力或細胞毒性活力

    1.一個孔中應接種多少個細胞當使用標準96孔板時·◕☁·↟,貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 / (100 μl 培養基)☁☁✘◕。檢測白細胞時的靈敏度相對較低·◕☁·↟,因此推薦接種量不低於2,500 / (100 μl 培養基)☁☁✘◕。如果要使用24孔板或6孔板實驗·◕☁·↟,請先計算每孔相應的接種量·◕☁·↟,並按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液☁☁✘◕。

    2.能否用384孔板進行試驗╃▩?

    可以☁☁✘◕。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液·◕☁·↟,如果加入的CCK-8體積太少·◕☁·↟,可以先將CCK-8溶液稀釋1倍·◕☁·↟,然後加入培養基體積20%的量☁☁✘◕。

    3.能否用24孔板進行試驗╃▩?

    可以☁☁✘◕。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液☁☁✘◕。

    4.酚紅會影響檢測嗎╃▩?

    不會☁☁✘◕。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時·◕☁·↟,透過扣除空白孔中本底的吸光度而消去·◕☁·↟,因此不會對檢測造成影響☁☁✘◕。

    5.CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性╃▩?

    有☁☁✘◕。然而·◕☁·↟,請注意由於CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同·◕☁·↟,因此結果可能不同☁☁✘◕。

    6.CCK-8能否檢測細菌細胞╃▩?

    可以檢測E.coli·◕☁·↟,但不能檢測酵母細胞☁☁✘◕。向100 μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液·◕☁·↟,隔夜或培養1-4個小時7.CCK-8穩定嗎╃▩?

    CCK-80-5下能夠儲存至少6個月·◕☁·↟,在-20下避光可以儲存1年☁☁✘◕。如果需要長期儲存·◕☁·↟,我們推薦-20的儲藏條件☁☁✘◕。

    8.如果沒有450 nm的濾光片·◕☁·↟,還可以使用哪些其他濾光片╃▩?

    還可使用450 nm490 nm之間的濾光片☁☁✘◕。

    9.如何減少由於CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差╃▩?

    可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑並混勻後加樣☁☁✘◕。

    10.CCK-8是什麼顏色╃▩?

    應該是粉紅色☁☁✘◕。若顏色不一樣·◕☁·↟,有可能會影響測定☁☁✘◕。

    11.CCK8能否對活細胞進行染色╃▩?

    不能☁☁✘◕。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)·◕☁·↟,並透過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上☁☁✘◕。由於生成的甲ā也是高度水溶性的·◕☁·↟,因此CCK8不能對細胞進行染色☁☁✘◕。

    12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒╃▩?

    CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性☁☁✘◕。但是·◕☁·↟,加到培養基中的CCK8是沒有毒性的·◕☁·↟,因為被稀釋了10倍☁☁✘◕。因此·◕☁·↟,長時間的培養·◕☁·↟,如隔夜或者培養數天是可以的☁☁✘◕。同一個細胞培養液在CCK8檢測後還可以用於其他細胞增殖檢測·◕☁·↟,如結晶紫檢測·◕☁·↟,中性紅檢測或者DNA熒光檢測等☁☁✘◕。由於每種細胞對於CCK8的耐受力都不同·◕☁·↟,因此在需要進行長時間培養時·◕☁·↟,先檢測一下細胞在加入CCK8培養後的活力☁☁✘◕。

    13.在做加藥實驗時·◕☁·↟,藥物對測定是否有影響╃▩?如何解決╃▩?

    有時會有影響☁☁✘◕。如果藥物具有還原性·◕☁·↟,會和CCK8發生顯色反應·◕☁·↟,增加吸光度☁☁✘◕。解決辦法▩✘:首先要確認藥物是否有吸收·◕☁·↟,在含有藥物的培養基中加入CCK8·◕☁·↟,測定450 nm的吸光度·◕☁·↟,如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (CCK8)的吸光度高·◕☁·↟,則證明藥物有影響·◕☁·↟,可在加CCK8之前更換培養基·◕☁·↟,去掉藥物的影響☁☁✘◕。

    14.每次測定的數值不一樣·◕☁·↟,是什麼原因╃▩?如何解決╃▩?

    可能會有以下幾個原因▩✘: 1. 當在培養箱內培養時·◕☁·↟,培養板zui外一圈的孔zui容易乾燥揮發·◕☁·↟,由於體積不準確而增加誤差☁☁✘◕。 一般情況下·◕☁·↟,zui外一圈的孔只加培養基·◕☁·↟,不作為測定孔用☁☁✘◕。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差·◕☁·↟,建議在加入CCK8後·◕☁·↟,輕輕敲擊培養板以幫助混勻☁☁✘◕。 3. 每孔的細胞數量過多或過少☁☁✘◕。請預先在1,000100,000/孔範圍內摸索條件☁☁✘◕。

    15.如何設定空白對照╃▩?

    在不含細胞的培養基中加入CCK8·◕☁·↟,培養一定的時間·◕☁·↟,測定450 nm的吸光度即為空白對照☁☁✘◕。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時·◕☁·↟,還應考慮藥物的吸收·◕☁·↟,可在不含細胞·◕☁·↟,加入藥物的培養基中加入CCK8·◕☁·↟,培養一定的時間·◕☁·↟,測定450 nm的吸光度作為空白對照☁☁✘◕。

    16.哪些物質會影響CCK8的測定╃▩?

    當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定·◕☁·↟,例如含有維生素CGlucose (一般培養基中的量不多·◕☁·↟,酚紅或血清不影響測定)☁☁✘◕。在有酚紅存在的情況下·◕☁·↟,會增加空白吸收·◕☁·↟,但不影響測定·◕☁·↟,扣除空白吸收即可☁☁✘◕。

    17.在實驗中吸光度值太高·◕☁·↟,如果不能減少細胞數量·◕☁·↟,如何解決╃▩?

    可以縮短加入CCK8後的培養時間☁☁✘◕。例如▩✘:可以把加入CCK8試劑後的培養時間由2小時縮短為1小時☁☁✘◕。

    18.設定參比波長的目的是什麼╃▩?必須設定嗎╃▩?

    不一定要設定☁☁✘◕。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度☁☁✘◕。設定參比波長的目的是為了取出由於樣品混濁所帶來的吸收☁☁✘◕。

    19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法·◕☁·↟,如果使用24孔板貨12孔板·◕☁·↟,應該加多少量CCK-8試劑╃▩?

    一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10☁☁✘◕。

    20.CCK-8顯色過程中·◕☁·↟,如何終止反應╃▩?

    有一下幾種方法(96孔板)▩✘: 1▩↟·•·、 在顯色反應後·◕☁·↟,將培養板彷彿4冰箱內☁☁✘◕。 2▩↟·•·、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液☁☁✘◕。 3▩↟·•·、 每孔加10 μl 1%w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液☁☁✘◕。注意▩✘:反應停止後·◕☁·↟,應在24小時之內測定☁☁✘◕。

    21.必須預培養細胞嗎╃▩?

    不一定☁☁✘◕。如果要向保持細胞的狀態·◕☁·↟,建議預培養細胞☁☁✘◕。如果不做細胞預培養·◕☁·↟,細胞內的脫氫酶可能會不穩定☁☁✘◕。也有人不做細胞預培養·◕☁·↟,但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件☁☁✘◕。

    22.如果加入的藥物中含有金屬·◕☁·↟,是否會有影響╃▩?

    金屬對CCK-8顯色有影響☁☁✘◕。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛▩↟·•·、氯化鐵▩↟·•·、硫酸銅會抑制5%▩↟·•·、15%▩↟·•·、90%的顯色反應·◕☁·↟,使靈敏度降級☁☁✘◕。如果終濃度是10 Mm的話·◕☁·↟,將會100%抑制☁☁✘◕。

    23.CCK-8試劑的儲存條件╃▩?

    在避光條件下CCK-8試劑在4可儲存一年☁☁✘◕。如果需要儲存較長時間的話·◕☁·↟,推薦在-20下儲存☁☁✘◕。但是CCK-8若反覆解凍和冰凍將會增加空白吸收·◕☁·↟,從而影響檢測結果·◕☁·↟,若經常使用可將試劑存放在4冰箱內儲存☁☁✘◕。

    24.預培養後·◕☁·↟,更換培養基需要細胞計數嗎╃▩?

    一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞·◕☁·↟,用血球計數盤計數·◕☁·↟,製備成一定濃度的細胞懸液即可☁☁✘◕。如果想要精密計數細胞的話·◕☁·↟,可以預培養後取培養基用血球計數盤進行計數☁☁✘◕。

    25.CCK-8對於不同的細胞·◕☁·↟,靈敏度是否一樣╃▩?

    不一樣·◕☁·↟,懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色☁☁✘◕。對於貼壁細胞·◕☁·↟,一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高·◕☁·↟,但對於懸浮細胞則可能吸光度較低·◕☁·↟,可以透過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決☁☁✘◕。

    26.懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別╃▩?

    懸浮細胞由於染色比較困那·◕☁·↟,一般需要增加細胞數量和延長培養時間☁☁✘◕。貼壁細胞染色比較容易·◕☁·↟,若細胞數量過大·◕☁·↟,有時吸光度會超過酶標儀的讀數☁☁✘◕。

    27.應該每次做標準曲線嗎╃▩?

    建議每次做☁☁✘◕。雖然細胞是一樣的·◕☁·↟,但是細胞的狀態不一定一樣·◕☁·↟,對於狀態不一樣的細胞·◕☁·↟,建議每次做標準曲線☁☁✘◕。如果試劑的批號不一樣·◕☁·↟,靈敏度可能會有輕微的差異·◕☁·↟,對於不同的批號建議分別做標準曲線☁☁✘◕。

    28.有時在藥物作用情況下·◕☁·↟,細胞已經死亡·◕☁·↟,但是脫氫酶的活性還在·◕☁·↟,是否能計算細胞數量╃▩?

    不能☁☁✘◕。由於CCK-8是透過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量·◕☁·↟,如果細胞已經死亡·◕☁·↟,但脫氫酶的活性還在·◕☁·↟,則試劑測定的細胞數量將會比真實值高·◕☁·↟,不能真實反映活細胞數量·◕☁·↟,建議採用別的方法測定☁☁✘◕。

    29.實驗之前·◕☁·↟,是否需要先檢測一下培養基和CCK-8是否會反應╃▩?

    建議使用一個孔作一下檢測·◕☁·↟,因為有培養基中可能含有氧化還原反應的物質·◕☁·↟,在正式實驗之前有必要先確認培養基和CCK-8是否反應☁☁✘◕。一般正常在的OD值應該在0.4以下☁☁✘◕。

    儲存條件▩✘:

    4乾燥避光儲存·◕☁·↟,有效期一年☁☁✘◕。

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