羅氏潮黴素B Roche Hygromycin B（潮黴素B）
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羅氏潮黴素B作用機制☁│₪：
潮黴素B是由吸水鏈黴菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素│☁✘◕，透過抑制蛋白質合成而殺死細菌│·、真菌和高等真核細胞│₪↟◕。潮黴素B透過干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成│₪↟◕。目前常用於篩選和維持培養含潮黴素抗性基因的原核或真核細胞│₪↟◕。
抗性基因☁│₪：
對潮黴素B的抗性源自編碼潮黴素B磷酸轉移酶（Hph）的基因│₪↟◕。至今發現兩種來源☁│₪：
Streptomyces hygroscopicus產生的Hph抗性基因；
Escherichia coli│☁✘◕，Klebsiella pneumoniae內質粒攜帶的Hph抗性基因（常用）；
羅氏潮黴素B生物應用☁│₪：
1） 篩選和維持培養穩定轉染Hph 載體的原核細胞或真核細胞（植物細胞和哺乳動物細胞）；
2）由於作用模式的差異│☁✘◕，常與G418 （GeneticinTM）│☁✘◕，Zeocin™和blasticidin S聯合使用│☁✘◕，篩選穩定轉染兩個不同載體的細胞株；
3）抗病毒劑│☁✘◕，由於潮黴素B選擇性滲透進入因為病毒感染增強通透性的細胞│☁✘◕，而且具有抑制翻譯的功效；
4）作為驅蟲藥加入動物飼料；
雙抗性穩定轉染細胞篩選的抗生素作用機制及抗性
抗生素抗性機制抗性基因哺乳動物篩選濃度
潮黴素B干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀Hph200~500μg/mL
G418干擾80S核糖體功能和抑制蛋白合成Tn5/Tn601100~1000μg/mL
Zeocin摻入或者切割DNA引起細胞死亡Sh ble50~100μg/mL
blasticidin S核糖體上抑制肽鍵形成Bsd/BSD3~50μg/mL
羅氏潮黴素B應用濃度☁│₪：
潮黴素B用來篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞型別│☁✘◕，培養基│☁✘◕，生長條件和細胞代謝率而變化│₪↟◕。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL│☁✘◕，*濃度需要殺滅曲線來確定│₪↟◕。
哺乳動物細胞·200-500 μg/mL；細菌/植物細胞·100-300 μg/mL；真菌·300-1000μg/mL；
羅氏潮黴素B產品使用☁│₪：
使用一☁│₪：殺滅曲線確定*殺死濃度（僅作參考│☁✘◕，因個人檢測體系而異）
（1）往組織培養級的96孔板內加入未轉染細胞│☁✘◕，細胞密度約50-200細胞/孔；細胞貼壁之後│☁✘◕，往每孔加入含不同濃度（如50-1000μg/mL│☁✘◕，至少5個濃度）潮黴素B的200μL新鮮培養基；
（2）37℃│☁✘◕，5% CO2培養箱孵育細胞10-14天；
（3）培養5-7天后更換新的培養液│☁✘◕，培養液內含有相應濃度的潮黴素B；
（4）10-14天后使用細胞增殖方法如MTT│☁✘◕，CCK-8等評估細胞活力；也可以透過檢測細胞克隆數或百分比匯合率來確定毒性效應│₪↟◕。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細胞的zui小濃度為*篩選濃度│₪↟◕。
使用二☁│₪：篩選穩定轉染細胞
（1）對於貼壁細胞│☁✘◕，直接吸去60mm培養皿內的轉染細胞培養基│☁✘◕，然後加入含有潮黴素B的新鮮培養基5-6ml；對於懸浮細胞│☁✘◕，無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉染細胞培養基│☁✘◕，然後懸浮在約5ml的含潮黴素B的新鮮培養基；
（2） 5-7天后│☁✘◕，如上方法更換含有潮黴素B的新鮮培養基；
（3） 再孵育細胞5-7天；
（4） 10-14天孵育後│☁✘◕，培養體系中只含有能夠表達潮黴素B抗性表型的活細胞│₪↟◕。因此篩選之後如步驟一│☁✘◕，更換不含潮黴素B的新鮮培養基│₪↟◕。
應用例項☁│₪：
物種細胞系/株質粒/載體篩選濃度
E.ColiHB101/XL1-Blue/K802pEX-295~950 μM
RiceProtoplast pTRA132/pTRA14195~285 μM
BarleyCallusbinary vector50 μg/mL
Aspergillus nidulansG191/pDJB3-1pDH25250 ,＞1000
ChickenB cell line DT40N/A1500μg/mL
HumanHEK293pUHD10-350 μg/mL
MouseJ1 ESpBS524200 μg/mL
HumanHMEC-1pCEP-4200 μg/mL
DrosophilaS2pAc, pCoHygro500 μg/mL
儲存方法☁│₪：溶液直接存放在2℃～8℃│☁✘◕，至少存放1年│₪↟◕。
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