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  • 羅氏潮黴素B Roche Hygromycin B(潮黴素B)
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    羅氏潮黴素B作用機制☁│₪:  

            潮黴素B是由吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素│☁✘◕,透過抑制蛋白質合成而殺死細菌│·、真菌和高等真核細胞│₪↟◕。潮黴素B透過干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成│₪↟◕。目前常用於篩選和維持培養含潮黴素抗性基因的原核或真核細胞│₪↟◕。 
     
    抗性基因☁│₪: 
    對潮黴素B的抗性源自編碼潮黴素B磷酸轉移酶(Hph)的基因│₪↟◕。至今發現兩種來源☁│₪: 
    Streptomyces hygroscopicus產生的Hph抗性基因;
    Escherichia coli│☁✘◕,Klebsiella pneumoniae內質粒攜帶的Hph抗性基因(常用);  
     
    羅氏潮黴素B生物應用☁│₪: 
    1) 篩選和維持培養穩定轉染Hph 載體的原核細胞或真核細胞(植物細胞和哺乳動物細胞); 
    2)由於作用模式的差異│☁✘◕,常與G418 (GeneticinTM)│☁✘◕,Zeocin™和blasticidin S聯合使用│☁✘◕,篩選穩定轉染兩個不同載體的細胞株;
    3)抗病毒劑│☁✘◕,由於潮黴素B選擇性滲透進入因為病毒感染增強通透性的細胞│☁✘◕,而且具有抑制翻譯的功效;
    4)作為驅蟲藥加入動物飼料; 
    雙抗性穩定轉染細胞篩選的抗生素作用機制及抗性
    抗生素抗性機制抗性基因哺乳動物篩選濃度
    潮黴素B干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀Hph200~500μg/mL
    G418干擾80S核糖體功能和抑制蛋白合成Tn5/Tn601100~1000μg/mL
    Zeocin摻入或者切割DNA引起細胞死亡Sh ble50~100μg/mL
    blasticidin S核糖體上抑制肽鍵形成Bsd/BSD3~50μg/mL

     
    羅氏潮黴素B應用濃度☁│₪: 
    潮黴素B用來篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞型別│☁✘◕,培養基│☁✘◕,生長條件和細胞代謝率而變化│₪↟◕。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL│☁✘◕,*濃度需要殺滅曲線來確定│₪↟◕。 
    哺乳動物細胞·200-500 μg/mL;細菌/植物細胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000μg/mL; 
     
    羅氏潮黴素B產品使用☁│₪:
    使用一☁│₪:殺滅曲線確定*殺死濃度(僅作參考│☁✘◕,因個人檢測體系而異)
    (1)往組織培養級的96孔板內加入未轉染細胞│☁✘◕,細胞密度約50-200細胞/孔;細胞貼壁之後│☁✘◕,往每孔加入含不同濃度(如50-1000μg/mL│☁✘◕,至少5個濃度)潮黴素B的200μL新鮮培養基;
    (2)37℃│☁✘◕,5% CO2培養箱孵育細胞10-14天;
    (3)培養5-7天后更換新的培養液│☁✘◕,培養液內含有相應濃度的潮黴素B;
    (4)10-14天后使用細胞增殖方法如MTT│☁✘◕,CCK-8等評估細胞活力;也可以透過檢測細胞克隆數或百分比匯合率來確定毒性效應│₪↟◕。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細胞的zui小濃度為*篩選濃度│₪↟◕。
    使用二☁│₪:篩選穩定轉染細胞
    (1)對於貼壁細胞│☁✘◕,直接吸去60mm培養皿內的轉染細胞培養基│☁✘◕,然後加入含有潮黴素B的新鮮培養基5-6ml;對於懸浮細胞│☁✘◕,無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉染細胞培養基│☁✘◕,然後懸浮在約5ml的含潮黴素B的新鮮培養基;
    (2) 5-7天后│☁✘◕,如上方法更換含有潮黴素B的新鮮培養基;
    (3) 再孵育細胞5-7天;
    (4) 10-14天孵育後│☁✘◕,培養體系中只含有能夠表達潮黴素B抗性表型的活細胞│₪↟◕。因此篩選之後如步驟一│☁✘◕,更換不含潮黴素B的新鮮培養基│₪↟◕。 
     
    應用例項☁│₪:
    物種細胞系/株質粒/載體篩選濃度
    E.ColiHB101/XL1-Blue/K802pEX-295~950 μM 
    RiceProtoplast pTRA132/pTRA14195~285 μM
    BarleyCallusbinary vector50 μg/mL
    Aspergillus nidulansG191/pDJB3-1pDH25250 ,>1000
    ChickenB cell line DT40N/A1500μg/mL
    HumanHEK293pUHD10-350 μg/mL
    MouseJ1 ESpBS524200 μg/mL
    HumanHMEC-1pCEP-4200 μg/mL
    DrosophilaS2pAc, pCoHygro500 μg/mL

    儲存方法☁│₪:溶液直接存放在2℃~8℃│☁✘◕,至少存放1年│₪↟◕。

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    主營☁│₪:生化試劑│·、抗體│·、蛋白/多肽│·、分子生物學│·、細胞生物學│·、Elisa試劑盒│·、發光試劑盒│·、培養基│·、細胞│·、蛇毒試劑│·、標準品│·、 標準溶液……
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