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  • 你知道無內毒素質粒小提中量試劑盒的操作方法麼?

  • 點選次數↟◕│:127 釋出時間↟◕│:【2022-04-18】
  •   你知道無內毒素質粒小提中量試劑盒的操作方法麼?不知道沒關係✘◕▩•,下面讓我們一起來了解一下吧╃↟。
     
      1·₪↟☁₪、取50µL新鮮的菌液接種到15-50mL(勿超過50mL)的LB培養基✘◕▩•,37oC震盪培養14-16小時╃↟。室溫下5,000xg離心10分鐘✘◕▩•,收集菌體✘◕▩•,並儘可能的吸去上清╃↟。
     
      2·₪↟☁₪、加入2.5mLBufferA1(確保已加入RNaseA)✘◕▩•,用移液器或渦流震盪確保**沉澱重新懸浮╃↟。
     
      3·₪↟☁₪、加入2.5mLBufferB1,輕輕地反轉5-10次以混合均勻✘◕▩•,然後靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清╃↟。
     
      4·₪↟☁₪、加入600µLBufferN3,立即反轉5次✘◕▩•,用手用力搖晃3-5次充分混勻✘◕▩•,此時出現白色絮狀沉澱╃↟。
     
      5·₪↟☁₪、將離心管轉至高速離心機✘◕▩•,在室溫下13,000xg離心10分鐘(若上清中有白色沉澱✘◕▩•,可再次離心)╃↟。
     
      6·₪↟☁₪、定量吸取離心後的上清液至新的15mL管中(避免吸起沉澱)✘◕▩•,加入0.1倍體積的EndoCleanBuffer✘◕▩•,混勻後冰浴10分鐘✘◕▩•,其間不時搖勻(若EndoCleanBuffer粘稠難吸✘◕▩•,可將槍頭剪掉頭後再吸取)╃↟。
     
      7·₪↟☁₪、室溫下(冰浴取出後務必使溶液溫度恢復到23oC以上✘◕▩•,否則溶液不分層)13,000xg離心10分鐘(也可在2,500xg離心15分鐘)╃↟。此時溶液分為兩層✘◕▩•,上層水相含有質粒✘◕▩•,下層紅色有機相含有╃↟。
     
      8·₪↟☁₪、將上層水相轉移至一個新的15mL管中✘◕▩•,加入3mL的BufferN3及3mL的100%ethonal✘◕▩•,用手用力甩5次以混勻✘◕▩•,該混合溶液需要需馬上進行過柱吸附操作╃↟。
     
      9·₪↟☁₪、立即轉移6.0mL裂解液至帶收集管的DNA柱中✘◕▩•,室溫下>2,500xg離心1分鐘✘◕▩•,倒掉收集管中的廢液✘◕▩•,將離心柱重新放回到收集管中╃↟。重複此步直至所有的溶液透過DNA柱╃↟。
     
      10·₪↟☁₪、可選:向DNA柱中加入3.0mLBufferKB,室溫下>2,500xg離心1分鐘✘◕▩•,倒掉收集管中的廢液✘◕▩•,將離心柱重新放回到收集管中╃↟。
     
      11·₪↟☁₪、向離心柱中加入5mL70%乙醇✘◕▩•,室溫下>2,500xg離心1分鐘✘◕▩•,倒掉收集管中的廢液✘◕▩•,將離心柱重新放回到收集管中╃↟。重複步驟“11”╃↟。
     
      12·₪↟☁₪、將離心柱放回高速離心機中✘◕▩•,室溫下>2,500xg開蓋離心10分鐘✘◕▩•,以徹底去除殘留的乙醇╃↟。
     
      13·₪↟☁₪、將離心柱轉至一個新的15mL離心管中✘◕▩•,向DNA柱膜的正中加入0.5mL的EndofreeElutionBuffer✘◕▩•,室溫放置1分鐘✘◕▩•,>2,500xg離心5分鐘✘◕▩•,以洗脫質粒DNA╃↟。若想提高得率✘◕▩•,可用洗脫得到的0.5mL的EndofreeElutionBuffer再洗脫一次✘◕▩•,收集到新的離心管中╃↟。
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